神经元分化，是指祖细胞通过有丝分裂产生神经元的过程，该过程由一系列转录因子（TFs）调节。这些TFs调节神经元末端效应基因的表达，这些基因可以调控神经元功能，例如神经递质、离子通道以及附加TFs。TFs必须驾驭复杂的染色质图谱，才能结合适当的增强子促进或抑制基因表达。但多数情况下，在神经元分化和成熟过程中，TFs表达下调，末端效应基因的表达却能保持稳定。那么关键TFs的短暂表达是如何维持基因转录？由于目前无法大规模地准确量化TFs基因组间的相互作用，这方面的研究进展缓慢。
2016年12月21日，Rhee教授及其同事在《神经元》杂志中发表了一篇论文，文章表明通过分析染色质可及性，并利用TFs结合位点的高分辨率映射可将胚胎干细胞（ESCs）逐步分化为下运动神经元。研究人员在一个可控制的体外系统再现了发育过程中TFs的动态表达，其中Isl1和Lhx3是成熟神经元效应基因转录所必需的转录因子，但Lhx3表达水平下调，并不改变末端效应基因的表达水平。ESCs在TFs的作用下先分化为表达 Isl1 和 Lhx3 的新生运动神经元，然后成熟为保留 Isl1 表达但Lhx3 表达水平下调的下运动神经元。
Rhee教授等研究人员采用染色质开放性测序技术（ATAC-seq）、通过转座子插入探测基因组的纳米探针技术以及组蛋白H3K27的染色质免疫沉淀测序技术（ChIP-seq）检测ESCs分化过程中染色质的可及性。他们观察到，基因表达的变化相对较小, 但在新生和成熟的下运动神经元分化过程之间存在非常活跃的活性增强子。
那么这些只有一小段可访问性的增强子的作用是什么？研究发现，Isl1和Lhx3以一种十分少见的方式来确保运动神经元分化期间基因稳定表达。在新生的运动神经元中，Isl1首先与Lhx3形成临时异源二聚体，与末端神经元效应基因非常靠近的瞬时增强子结合。随后，由于Lhx3在神经元成熟期间被下调，Isl1被释放与相同神经元效应基因中新位点的Onecut1相结合（图1A）。Isl1分别与早期和成熟增强子结合的这种中继作用，确保效应基因持续表达，该产物对成熟神经元功能至关重要。相比之下，Ngn2在分化开始时短暂表达，通用神经元识别必要的、与Isl1异源二聚体共享很少的位点进行结合，这表明它独立工作激活另一组神经元分化所需的基因。
在接下来的实验中，Rhee 等人研究了早期和成熟增强子在人体内是否具有时间特异性。研究人员准备了一组人工增强子，在胚胎鸡脊髓运动神经元分化过程中控制GFP的表达。实验结果表明，早期增强子在电穿孔后 24 小时内促进产生 GFP，但无法在 48 小时内维持 GFP的表达，而成熟增强子直到电穿孔后 48 小时才促进GFP表达水平上调。在与内源性神经元基因类似的结构中，与早期和成熟增强子结合的报告基因在运动神经元分化过程中持续促进GFP的表达。使用 CRISPR/Cas9 引导去除与 Isl1 和运动神经元基因 Hb9 相关的早期和成熟增强子，在ESCs的运动神经元分化中进一步验证了这一阶段增强子的时间特异性。
Isl1 从早期增强子到成熟增强子的逐步转移是如何发生的呢？Rhee教授称Isl1 转移是通过竞争性结合发生的，其中 Lhx3 与 Onecut1 竞争与Isl1 结合，Isl1转移到 Onecut1 可能是由于 Lhx3 在神经元成熟时表达水平下调。有趣的是，Isl1主要与Lhx3 或 Onecut1相互作用，在此之前Lhx3和Onecut1已经与它们的增强子结合，与Isl1结合之后激活相关基因。这项成果表明基因可以通过 Onecut1 和 Lhx3 等因子启动表达，随后通过Isl1的竞争性转移，激活并稳定表达。这为基因转录状态增加了另一个维度，同源“锚点”（例如 Lhx3 或 Onecut1）可诱导结合与基因转录相关的转录因子，激活并稳定基因表达。
(A) 在诱导神经元分化过程中，外源性应用维甲酸 (RA)、平滑激动剂 (SAG) 和 g-分泌酶抑制剂 (DAPT) 促进胚胎干细胞 (ESCs) 在 6 天内分化为下运动神经元。在分化过程中，神经元效应器的表达由作用于早期瞬时增强子的 Isl1/Lhx3 异二聚体激活表达，然后下调 Lhx3 并将 Isl1 转移到 Onecut1 结合成熟的增强子上维持表达。
(B)神经元分化通过编程强制表达转录因子,在 48 小时内将 ESCs分化为新生运动神经元—— Lhx3、Isl1 和 Ngn2.Lhx3/Isl1 与早期增强子结合抑制增殖基因的表达，随后转移到成熟增强子与 Onecut 和 Ebf 转录因子结合促进神经元效应基因表达。
新生的运动神经元也可以通过直接编程ESCs分化得到，该方法通过强制表达 Isl1 和 Lhx3 以及 Ngn2，使神经元效应基因在 48 小时内持续表达。
与 ESCs的逐步分化相比，同一类TFs如何在染色质可及性和可用辅助因子不一致的情况下诱导效应基因转录？Velasco教授及其同事分析了 Ngn2、Lhx3 与Isl1 结合过程中动力学原理及其在运动神经元分化中开始 48 小时内对转录组和染色质行为的影响。值得注意的是，增强子的整体作用逻辑也适用于直接编程运动神经元，但稍有不同。Velasco 教授使用 ChIP-seq技术发现大量与Lhx3/Isl1 异二聚体结合的早期增强子，这些增强子与祖基因相关，而不是与神经元效应基因相关。此外，随着早期增强子与Lhx3/Isl1之间相互作用促进基因表达的能力慢慢减弱，染色质状态受限制程度越来越高。随后，Lhx3/Isl1与神经元功能相关的末端效应基因上的成熟增强子相结合，这些成熟增强子与Lhx3/Isl1之间相互作用促进基因表达。该系统中转录因子在两步过程中抑制祖细胞特征并促进神经元分化。
Velasco教授等研究人员表明，在定向分化的条件下，Isl1 在晚期增强子处与 Lhx3 和 Onecut 相互作用（图 1B），这些对比观察结果与 Rhee 等人提出的竞争性结合模型情况不符。可能是由于直接分化过程中Isl1/Lhx3突然和持续的表达，或者是它缺乏外源性 RA-Shh 和 Notch 抑制诱导的分化程序，Isl1/Lhx3 可以访问在ESCs诱导分化过程中不采用的结合位点。此外，如果Isl1表达过量并保持 Lhx3表达水平，则 Isl1 与 Onecut1 或 Lhx3 的竞争性结合可能无关紧要，Isl1 和 Lhx3可同时与成熟的增强子结合。直接分化过程中TFs的受控表达确实为研究人员提供了了解每个TFs独立作用的机会。
通过敲除 Lhx3 和 Isl1，Velasco 等研究人员揭示 Ngn2促进了One-cut和EbfTFs 的后续表达。此外，如果 Lhx3/Isl1在没有Ngn2 的情况下表达，它们向晚期增强子转移的能力会严重降低。这阐明了 Ngn2 和 Isl1/Lhx3 分别与两组互斥增强子初始结合后，如何最终汇聚在成熟增强子上，从而形成基因调控的前馈控制系统。这两项研究都说明了增强子在细胞进行有丝分裂形成神经元过程中的重要性。
利用前馈TFs系统按次序分程调节基因表达是否具有生物学价值？在分化过程中，运动神经元亚型分化需要维持一般神经元基因表达和激活细化神经元亚型的特定基因表达，如离子通道表达以控制尖峰频率。早期增强子的短暂结合可能会触发一系列TFs，每个TFs都与瞬时增强子结合以产生下一组继续细化基因表达的TFs。随着这种前馈过程的进行，中继增强子可以稳定神经元亚型之间的基因表达。在成熟神经元中持续使用瞬时增强子将极大地加快细胞重编程和细胞替代疗法的研究进程。由于这些神经元模型在临床和研究环境中的效用，研究人体内环境与运动神经元逐步或直接分化后最终状态之间的联系则至关重要。这些研究为有丝分裂后基因的表达和细胞分化过程中染色质景观的重组所必需的机制提供了相对可靠的结论，也为继续深入研究提供了可能性。
宁波易赛腾生物科技有限公司 李福云编译
原文链接：
Transcription Factor Hand-offs “Enhance” Motor Neuron Differentiation - ScienceDirect
